在FCM檢測(cè)中，所有細(xì)胞均會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，最終結(jié)果是細(xì)胞自身非特異性熒光與特異性結(jié)合熒光的疊加效果。為排除干擾、確保結(jié)果可靠，需設(shè)置陰性對(duì)照——這是一類對(duì)照的統(tǒng)稱，核心目的是“確定陰性基準(zhǔn)、排除假陽性"，根據(jù)干擾來源不同可分為空白對(duì)照、陰性細(xì)胞對(duì)照、同型對(duì)照等類型，其中空白對(duì)照是最基礎(chǔ)的類型，各類對(duì)照的具體功能與邊界如下：

1.1空白對(duì)照：排除“檢測(cè)系統(tǒng)"相關(guān)假陽性

空白對(duì)照指未添加任何熒光染色試劑的樣本（如僅含細(xì)胞和緩沖液的樣本），主要針對(duì)“檢測(cè)系統(tǒng)本身"的干擾，核心作用包括：

確定陰性細(xì)胞群的基礎(chǔ)位置，同時(shí)輔助判斷細(xì)胞大小、顆粒度等固有參數(shù)。

區(qū)分細(xì)胞的本底自發(fā)熒光與實(shí)驗(yàn)過程引入的非特異性熒光（如試劑殘留、操作污染及儀器本底熒光等）。

調(diào)節(jié)儀器電壓參數(shù)，使陰性細(xì)胞信號(hào)處于各通道合適區(qū)間，避免電壓過低導(dǎo)致“壓線"或過高導(dǎo)致信號(hào)溢出。

直觀呈現(xiàn)細(xì)胞的本底信號(hào)水平，便于后續(xù)圈門分析時(shí)直接排除非特異性信號(hào)群體。

1.2陰性細(xì)胞對(duì)照：排除“細(xì)胞自身特性"相關(guān)假陽性

陰性細(xì)胞對(duì)照指已知不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞樣本，包括未受目標(biāo)抗原刺激或自然狀態(tài)下不表達(dá)該抗原或經(jīng)過基因敲除的細(xì)胞（如明確不表達(dá)CD3的HEK293細(xì)胞），主要針對(duì)“細(xì)胞自身特性"的干擾，核心作用包括：

排除特定細(xì)胞系因表面結(jié)構(gòu)、高自發(fā)熒光等固有特性導(dǎo)致的假陽性。

驗(yàn)證檢測(cè)體系對(duì)“明確陰性細(xì)胞"的識(shí)別能力，確保實(shí)驗(yàn)體系的特異性。

適用于新細(xì)胞樣本或未知抗原表達(dá)情況的檢測(cè)場(chǎng)景，作為陽性結(jié)果的“陰性基準(zhǔn)"。

1.3同型對(duì)照：排除“樣本-抗體結(jié)合"相關(guān)假陽性

同型對(duì)照指用與特異性抗體同亞型、同熒光素的無關(guān)抗體染色的樣本，主要針對(duì)“抗體非特異性結(jié)合"的干擾，詳見“同型對(duì)照"章節(jié)。

3.1空白對(duì)照的正常信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)：參數(shù)調(diào)節(jié)合適后，各檢測(cè)通道的陽性信號(hào)占比應(yīng)低于0.5%；若細(xì)胞自發(fā)熒光較強(qiáng)，僅靠補(bǔ)償調(diào)節(jié)難以消除，需結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化（如更換熒光素、調(diào)整樣本處理方式）。

3.2對(duì)照選擇原則：?jiǎn)我粚?duì)照無法覆蓋所有干擾，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕M合使用（如常規(guī)抗體染色實(shí)驗(yàn)，需同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和同型對(duì)照）。

3.3局限性明確：空白對(duì)照不能替代同型對(duì)照/陰性細(xì)胞對(duì)照，因空白對(duì)照未涉及抗體結(jié)合、細(xì)胞特性等干擾，無法界定陽性門或排除細(xì)胞自身相關(guān)假陽。

這里對(duì)同型對(duì)照（Isotype Control）的意義做進(jìn)一步闡明。

流式抗體通過Fab端與靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合。但白細(xì)胞（除T細(xì)胞外）表面大多表達(dá)CD16、CD32、CD64等Fc受體，這些受體可與各種抗體的Fc端非特異性結(jié)合，出現(xiàn)非特異性染色，其中以單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞尤甚。此外，在活細(xì)胞的表面染色實(shí)驗(yàn)中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均存在吞噬抗體的現(xiàn)象。在多色流式實(shí)驗(yàn)中，還存在熒光背景的影響及藥物處理的影響，即便對(duì)Fc受體進(jìn)行了封閉，在分群不好的情況下，依然需要用到同型對(duì)照。

同型對(duì)照是用于消除抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，由與一抗具有相同種屬來源、免疫球蛋白亞型、亞鏈和熒光標(biāo)記方式的非特異性免疫球蛋白構(gòu)成。與一抗保持相同的熒光染料-蛋白比值，以準(zhǔn)確設(shè)定陰陽性閾值。其原理是通過匹配一抗的Fc區(qū)特征，阻斷Fc受體或補(bǔ)體介導(dǎo)的非特異性結(jié)合，從而驗(yàn)證抗體結(jié)合的特異性。如果沒有適合的同型對(duì)照，在保持種屬來源、熒光標(biāo)記方式、免疫球蛋白類別相同的條件下，優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是類別相同→亞型相同→亞鏈不同。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果僅僅參照陰性對(duì)照來圈門，就可能出現(xiàn)一部分假陽性結(jié)果。如果參考同型對(duì)照來區(qū)分陰陽性，就能夠把這部分非特異性結(jié)合造成的假陽性排除。但同型對(duì)照只能作為一種參考，不能直接以此為依據(jù)來確定陽性陰性分界點(diǎn)，或以此圈門。因?yàn)橥蛯?duì)照只能反映非特異性結(jié)合的背景熒光，不能排除其他相關(guān)影響因素。

造成非特異性染色的原因有多種，同型對(duì)照可以指示實(shí)驗(yàn)步驟是否需要進(jìn)一步優(yōu)化。如果是由于細(xì)胞未封閉，同型對(duì)照與Fc受體結(jié)合，則應(yīng)該優(yōu)化封閉條件。如果是由于死細(xì)胞的存在，則需要同型對(duì)照與活死細(xì)胞染料聯(lián)合使用。

1.排除抗體因電荷、結(jié)構(gòu)等特性與細(xì)胞表面非特異性結(jié)合產(chǎn)生的假陽信號(hào)。

2.精準(zhǔn)界定染色樣本的陽性門位置，這是空白對(duì)照無法實(shí)現(xiàn)的功能，因為空白對(duì)照未涉及抗體結(jié)合過程。

3.驗(yàn)證陽性信號(hào)是否來自特異性的抗原-抗體結(jié)合，尤其適用于弱表達(dá)抗原的檢測(cè)場(chǎng)景。

1.對(duì)于陰陽性分群明顯的指標(biāo)，不需要同型對(duì)照即可設(shè)門，例如CD3、CD4、CD8等用于T細(xì)胞的檢測(cè)指標(biāo)。對(duì)于陰陽性分群不清楚的指標(biāo)，例如CD25、CD69、CD38等活化指標(biāo)，及IFN-γ、IL-4、IL17A等細(xì)胞因子，則需要設(shè)置同型對(duì)照。

2.在某些特殊情況下，如單核細(xì)胞被PE/Cy7、APC/Cy7等串聯(lián)染料標(biāo)記的抗體染色時(shí)，因?yàn)閱魏思?xì)胞一般傾向于與Cy7等染料非特異性結(jié)合，使用同型對(duì)照有助于獲得理想結(jié)果。

3.不清楚抗原表達(dá)情況的時(shí)候，一定要使用同型對(duì)照來界定陰性細(xì)胞群。

4.胞內(nèi)染色時(shí)，因?yàn)榘麅?nèi)指標(biāo)表達(dá)量一般不會(huì)太高，胞內(nèi)染色過程也非常容易導(dǎo)致抗原抗體非特異性結(jié)合。

1.購買同一廠家的流式抗體和同型對(duì)照，不同廠家的熒光染料和抗體結(jié)合的比率可能是不同的。

2.流式抗體和同型對(duì)照的使用劑量和濃度需保持一致。

3.細(xì)胞非特異性熒光的強(qiáng)弱由細(xì)胞本身所決定，與細(xì)胞的體積大小有關(guān)，一般細(xì)胞體積越大，其非特異性熒光就越強(qiáng)；體積越小，其非特異性熒光就越弱。分析每一種細(xì)胞時(shí)，都需要設(shè)定這種細(xì)胞的同型對(duì)照，不能用一種細(xì)胞的同型對(duì)照值分析另外一種細(xì)胞，尤其是在體積相差較大時(shí)。

4.在進(jìn)行多色流式實(shí)驗(yàn)時(shí)，熒光滲漏對(duì)結(jié)果的影響較為明顯，同型對(duì)照無法反映出其它通道滲漏的熒光背景。這時(shí)就需要通過同型對(duì)照與熒光減一對(duì)照（Fluorescence Minus One, FMO）的聯(lián)合使用，即減一對(duì)照與被去掉的抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體的組合對(duì)照，消除熒光溢漏和非特異性結(jié)合造成的影響。